جداسازی، تکثیر و همسانه سازی ژن اسموتین از گیاه توتون و مطالعه تأثیر بیان پروکاریوتی آن بر رشد برخی قارچ های بیماری زای گیاهی

در این تحقیق ژن اسموتین گیاه توتون با تکنیک pcr از dna ژنومی گیاه توتون جداسازی و سپس در ناقل pjet1.2 همسانه سازی شد. صحت همسانه سازی ژن در ناقل با روش های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید و ناقل نوترکیب حاصله pjaa-1 نام گذاری شد. ژن اسموتین پس از همسانه سازی توسط هضم آنزیمی از ناقل همسانه سازی خارج و در ناقل بیانی pet26b(+) کلون شد. صحت همسانه سازی ژن با روش های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید و ناقل نوترکیب حاصله peaa-2 نام گذاری شد. ناقل peaa-2 به سویه های باکتریایی e. coli bl21(de3) و e. coli rosetta (de3) منتقل شد. بیان اسموتین در دو سویه فوق در شرایط مشابه انجام و با استخراج پروتئین تام سلولی و با تکنیک sds-page باند پروتئینی مورد نظر مشاهده و با تکنیک لکه گذاری وسترن تایید شد. با توجه به رشد بهتر باکتری های e. coli bl21(de3) در شرایط مشابه و سطح بالاتر بیان، این سویه برای ادامه کار استفاده شد. اثر فاکتورهای iptg، دما و زمان نمونه گیری بر روی بیان اسموتین با کمک روش تاگوچی بهینه سازی شد. نتایج به دست آمده نشان دادند که شرایط بهینه بیان دمای 33، زمان 16 ساعت و غلظت القا کننده iptg 7/0 میلی مولار است. بررسی ها نشان داد پروتئین نوترکیب بیان شده عمدتاً به شکل نامحلول اینکلوژن بادی در سلول انباشته می شود؛ لذا پس از محلول ساختن این توده ها در بافرهای حاوی مواد واسرشت ساز نظیر اوره و احیا کننده مانند مرکاپتواتانول شرایط ایجاد ساختمان طبیعی تأمین شد. پروتئین بدست آمده پس از دیالیز، توسط ستون نیکل تخلیص و غلظت آن با کمک روش برادفورد سنجیده شد. اثر اسموتین نوترکیب بر قارچ های rhizoctonia solani، botrytis cinerea، sclerotinia sclerotiorum، fusarium oxysporum، verticillium dahliae و alternaria solani توسط روش های radial diffusion، disk diffusion و spore germination بررسی و مشاهده شد که این پروتئین رشد قارچ های فوق را مهار می کند. از این رو می توان نتیجه گرفت که پروتئین مزبور در سیستم پروکاریوتی به صورت فعال بیان می شود و می تواند رشد قارچ را مهار کند.